Zellkultur-Kontaminationen: Bakterien, Hefen und Pilze

Früher oder später hat jeder von uns eine Kontamination in seinen Kulturen. Allerdings ist es in frühen Stadien oft schwierig zu sagen, ob man eine Kontamination hat oder sich in der Kultur nur Debris angesammelt hat. Daher wollen wir Ihnen hier eine Übersicht über das Aussehen von Bakterien, Hefen und Pilzen in Kulturen geben. Weitere Hilfestellung bekommen Sie auch in unseren Kursen Kontaminationsvermeidung, Aseptik und Hygiene, Qualitätsmanagement sowie Mykoplasmennachweis und Eliminierung.

Bakterien als Zellkultur-Kontamination

Bakterien sind die häufigsten Zellkultur-Kontaminanten. Sie gelangen meist durch Fehler beim Bearbeiten in die Kultur. Da Bakterien eine sehr kurze Generationszeit haben, überwachsen sie die Kulturen meist innerhalb von 2-3 Tagen wobei sich das Medium oft vorzeitig gelb verfärbt. Antibiotika können dies verzögern und damit das Erkennen einer Kontamination erschweren.

Stark kontaminierte Kultur mit Bakterien-Aggregaten	Bakterien im Vergleich zu runder Hefe	Schematische Zeichnung von Bakterien-Morphologien
Bakterien	Bakterien (dunkel) und Hefe (hell)	(c) Pearson Scott Foresman: Kokken, Spirillen, Stäbchen

Im linken Bild sind einzelne Bakterien (Kokken oder kurze Stäbchen und dunkel gefärbte Baterienklumpen zu sehen. Kenneth Todar, der uns mikrobiologisch unterstützt, merkt hierzu an, dass Kokken normalerweise eher zu Klumpen neigen als Stäbchen, obwohl manche, nicht motile Stäbchen auch Klumpen bilden.

Im unteren Bild sieht man eine stark kontaminierte Suspensionskultur (U937). Im Vergleich zu den runden Zellen (größter Durchmesser, gelbliche Mitte, heller Ring) kann man deutlich die kleineren runden Hefen (ganz weiß) und unterschiedliche Bakterien (schwarz/grau und von stäbchen-förmig bis fast wurmartig) unterscheiden. Auch bei großer Auflösung ist nur schwer eine Einordnung vorzunehmen, aber Kenneth Todar hält einen Bacillus Vertreter, vielleicht Bacillus megaterium für wahrscheinlich. Wer seine Keime genauer analysieren möchte, kann Hilfestellung auf Kenneths Seite "the normal flora of humans" finden.

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Mischung: Suspensionszellen (groß), Hefen (mittelgroß, rund, hell), Bakterien (schwarz, Fäden)

Hefen als Zellkultur-Kontamination

Hefen sind seltenere Zellkultur-Kontaminanten und gehören zu den Pilzen. Sie gelangen meist durch Fehler beim Bearbeiten in die Kultur. Da Hefen eine kurze Generationszeit haben, wird eine Kontamination meist innerhalb von 2-3 Tagen sichtbar, wobei sich das Medium nicht deutlich vorzeitig gelb verfärbt. Antibiotika sind nicht mykostatisch/mykotoxisch, d.h. sie sind gegen Hefen wirkungslos.

Hefe-Zellen (400x vergrößert) in Suspension	Subkonfluente HeLa-Zellen mit Hefe-Kontamination	Konfluente HeLa-Zellen mit Hefe-Kontamination

Zellen (grau-schwarz und große runde), Hefe (klein, rund, hell)

Im unteren Bild sieht man eine stark kontaminierte Suspensionskultur (U937). Im Vergleich zu den großen runden Zellen (größter Durchmesser, gelblich) kann man deutlich die kleineren runden Hefen (ganz weiß) erkennen. Hefen wachsen eigentlich als Einzelzellen. Je stärker die Kontamination jedoch ist, desto mehr verklumpen die Hefen auch.

Zellen (Suspensionszellen, groß, rundlich, oval, außen hell, innen gelblich), Hefe (deutlich kleiner, eher kreisrund, ganz hell)

Pilze als Zellkultur-Kontamination

Pilze gelangen meist als Sporen in die Kultur, wachsen dann aus und bilden nach einiger Zeit Hyphen, die bis zu einem dichten Mycel werden können.

Pilz in einer Suspensionskultur (U937)	Pilzhyphen mit Sporangien und Sporen	Auswachsende Pilzsporen 400x vergrößert
Pilz (Klumpen links, mit Fäden), Suspensionszellen (groß, mit hellem Rand), Hefen (klein, rund)	Pilz (fädige Struktur), Sporangien (dunkel, "Luftballon" und "Wattestäbchen")	Pilz (fädig, hell), Sporen (rund, hell)

Im unteren Bild sieht man Pilzhyphen in 400x Vergrößerung. Deutlich treten im Phasenkontrast die Septen (Zelltrennwände) der Hyphen hervor. Links sieht man kleine Sporen, die aus den Sporangien (große, oval-längliche und dunkel erscheinende Endbereiche) freigesetzt wurden. Die Sporen sind deutlich kleiner als Hefen und in ihrer Größe einheitlicher.

Pliz (fädig, septiert = Zebramuster), Sporangien (dunkel, "Luftballon" und "Wattestäbchen")

Kontaminationsquellen

In den meisten Fällen ist die Ursache für eine Kontamination ein Fehler in der sterilen Arbeitstechnik. Während Anfänger aus Unerfahrenheit Fehler machen, ist es bei der "alten Hasen" meist eher die Geschwindigkeit oder die Menge an Kulturen, die gleichzeitig bearbeitet werden, die zu Fehlern führen. Hier einige Tipps:

• Steriles Arbeiten und Hektik passt nicht zusammen
• Immer nur eine Kultur oder Linie unter der Bank bearbeiten
• Antibiotika kaschieren Fehler. Wer sie nicht weglassen kann oder möchte, sollte ab und an eine Kultur ohne Antibiotika kultivieren. Dies zeigt zum einen Fehler auf und gibt zum anderen sogenannten gedeckelten Kontaminationen (durch Antibiotika gebremste, aber vorhandene Kontamination) die Chance hochzuwachsen und erkannt zu werden. Dies verhindert das Verschleppen.
• Kontaminationen dokumentieren und wenn möglich klassifizieren soweit es geht.
• Wer ab und an Pilzkontaminationen hat, sollte seinen Inkubator checken und überprüfen, ob das Labor regelmäßig mit anderen als alkoholischen Mitteln desinfiziert wird.
• Wer im Sommer häufiger Hefekontaminationen hat, sollte seinen Hygieneplan prüfen, da Hefen fast immer von außen eingebracht werden.
• Wer ganz sicher sein möchte, sollte neue FCS Chargen immer auf Sterilität (Bakterien, Hefen, Pilze, Mykoplasmen) testen.