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Coating (Beschichtungen) für Zellkultur-Plastik

Als Coating oder Beschichtung von Zellkulturplastik bezeichnet man alle Oberflächenmodifikationen zur Adhäsion, die über die Corona- oder Plasmabehandlung beim Hersteller hinausgehen. Beide Begriffe werden synonym benutzt.

Typen von Beschichtungen in der Zellkultur

Wie hier beschrieben, besteht praktisch jedes Zellkultur-Plastik aus Polystyrol und wird von jeweiligen Hersteller zur Verbesserung der Zellanheftung oberflächenbehandelt. Trotz allem ist diese Oberfläche jedoch keine annähernd natürliche Oberfläche wie Zellen sie im Gewebe vorfinden können. D.h. die Komplexität des Zellkulturmodels in Bezug auf die Adhäsionsoberfläche kann von einfach bis histotypisch (gewebeähnlich) reichen:

  • Unbehandeltes Polystyrol (Bakterienschalen), hydrophob und nur für wenige Zelltypen anwendbar (z.B. Schilddrüsenzellen, Keratinozyten)
  • Oberflächenbehandeltes Polystyrol (normales Zellkulturplastik), polar und/oder geladen je nach Hersteller
  • Einfache, künstliche, kostengünstige Beschichtung
        x  Poly-L-Lysin, Poly-D-Lysin
        x  Poly-Ornithin
  • Einfache, kostengünstige, unspezifisch proteinäre Beschichtung
        x  Gelatine
  • Spezifische extrazelluläre Matrixbeschichtung mit einem Protein (teurer, meist Isolate aus tierischem Gewebe))
        x  Collagen I, IV
        x  Fibronektin
        x  Laminin
        x  Vitronektin
        x  Osteopontin
  • Spezifische Teilsequenzen extrazellulärer Matrixproteine (teilweise noch teurer, teilweise GMP-konform, da synthetisch hergestellt)
        x  RGD-Motive
        x  Fibronektin-Domänen
  • Spezifische, komplexe Matrixbeschichtung
         x  Matrigel (mehrere Komponenten der Extrazellulären Matrix mit gebundenen Wachstumsfaktoren etc.)
  • 3D Modelle in denen die Zellen in eine Matrix oder ein Gel eingebettet sind, u.a.
        x  Collagengele
        x  Matrigele
        x  Alginatgele
        x  Lactatgele

PLL Struktur

 

 

Fibronektin Struktur

 

Warum verwendet man Coatings ?

Beschichtungen sind aufwendiger und teurer als die Kultur in normalen Zellkulturgefäßen. Für die meisten Grundlagenexperimente mit Zelllinien ist eine künstliche Oberfläche ausreichend, jedoch gibt es verschiedene Gründe aus denen man auf aufwendigere beschichtete oder gecoatete Oberflächen wechselt:

  • Ohne Beschichtung haften die Zellen nicht oder sehr schlecht (Primäre Neurone, Oligodendrozyten, Hepatocyten)
  • Die Beschichtung verhindert das Abwaschen der Zellen im Assay (HEK293, OLN93, HepG2)
  • Die Beschichtung trägt zur Differenzierung der Zellen bei (Neurone, Glia, Keratinocyten, Hepatocyten)
  • Ohne Beschichtung werden die Zellen seneszent oder dedifferenzieren (MSC, Hepatocyten)
  • Die Zellen bilden auf der Beschichtung eine komplexere Morphologie (Glia, Neuronen, Hepatozyten, HepG2, Keratinozyten)
  • Die Zellen polarisieren nur auf der Beschichtung (Schilddrüsenzellen, Hepatocyten, Keratinocyten)
  • Es wird mit serumfreien Medien gearbeitet und die Zellen können ohne Beschichtung nicht überleben, proliferieren oder adhärieren (s.u.) (MSC, Stammzellen)
  • Die Fragestellung ist sehr spezifisch und kann nur in einem echten 3D-Model beantwortet werden (Hautmodelle, Sphäroide, Angiogenese, Knochen, Knorpel)

Generell wachsen alle Zellen lieber und meist auch besser auf einer beschichteten als unbeschichteten Oberfläche. D.h. der Experimentator entscheidet je nach Fragestellung und Notwendigkeit. Für anspruchslose Zelllinien besteht nicht die Notwendigkeit zur Beschichtung daher nutzt man ungecoatetes Plastik. Bei anspruchsvolleren Linien und speziell Primärzellen dagegen ist oft eine Beschichtung für die normale Zellkultur hilfreich und manchmal sogar unabdingbar ist. Je "näher" außerdem die Umgebung der Zellen an der natürlichen Gewebesituation ist, umso übertragbarer sind dann natürlich auch die Ergebnisse.

 

Anwendungsbeispiele für Beschichtungen

Serumfreie oder xenofreie Zellkultur von MSCs (mesenchymalen Stammzellen)

In den nachfolgenden Abbildung von denovoMATRIX sieht man wie für die Kultur von mesenchymalen Stammzellen (MSC) mit dem Wechsel von einem FCS- oder serumhaltigen Medium zu einem serumfreien oder Xeno-freien Medium die Notwendigkeit eines Coatings entsteht. Die anspruchsvollen MSC können nicht an das Zellkulturplastik anheften, wenn ihnen Serumproteine fehlen, die dies ermöglichen. Dies wird durch die Beschichtung ausgeglichen.

MSC auf DeNovo Matrix in verschiedenen Medien

© denovoMATRIX modified by InCelligence

Kultur von humanen Fibroblasten auf verschiedenen Oberflächen mit FCS-haltigem Medium

Die nachfolgende Grafik zeigt, dass im unter normalem Kulturbedingungen, also mit FCS im Medium, humane Fibroblasten mit normalen Oberflächen von ungecoatet über PLL-gecoated bis bin zu Fibronektin-beschichtet sehr gut klarkommen. Nur auf nicht behandeltem Plastik (ähnlich Bakterienschalen) zeigt sich der Effekt der Coatings. Für diese primären Zellen wäre also für die normale Kultur kein Coating nötig.

MSC auf DeNovo Matrix in verschiedenen Medien

© InCelligence aus Kurs Bioassays

PLL-Beschichtung von 96-well Platten als Schutz vor HEK 293 Zellverlust im Bioassay

In aufwendigen Bioassays mit vielen Waschschritten kommt es oft vor, dass Teile der Zellen oder fast alle Zellen im Verlauf einer Färbung oder eines ELISA abgewaschen werden. Dies erhöht die Standardabweichung erheblich oder führt sogar dazu, dass ein Assay gar nicht mehr auswertbar ist. Um dies zu vermeiden kann man bei allen Zellen vor allem aber bei schlecht haftenden wie HEK 293 oder OLN 93 die Oberflächen der Multiwellplatten mit z.B. PLL beschichten. Hierdurch wird mind. ein Großteile des Abspülens vermieden oder mit der richtigen Technik und bei der richtigen Zellzahl das Abspülen sogar komplett vermieden. In der nachfolgenden Abbildung sieht man den Effekt zahlreicher Waschschritte auf HEK-Zellen in einem Kristallviolett-Assay für den identische Zellzahlen auf Platten mit und ohne PLL-Coating ausgesät wurden. Der protektive Effekt ist überall deutlich sichtbar an der intensiveren Farbe außer in der ersten Reihe (jeweils links).

HEK Zellen mit und ohne PLL coating auf Greiner Plastik

© InCelligence aus Kurs Bioassays

Extrazelluläre Matrix als Richtungsweiser für die Differenzierung

Für bestimmte Zelltypen ist die extrazelluläre Matrix auch eine Orientierungshilfe in welcher Umgebung, wo im Gewebe oder neben welchen anderen Zelltypen sie sitzen. Diese Signale werden über die Integrinbindung in intrazelluläre Signale übersetzt und können dann die Proliferation, Migration oder die Differenzierung beeinflussen. In der nachfolgenden Abbildung sieht man gemischte Gila aus neonatalem Rattenhirn in einer GFAP-Färbung für Astrozyten auf drei verschiedenen Oberflächen.

Ratten-Astrozyten auf PLL, Fibronektin und Laminin

© InCelligence aus Zellkultur-Basis-Kurs

 

Marktübersicht Coatings

Nachfolgend sieht man in der Tabelle eine aktuelle Marktübersicht der verschiedenen Beschichtungen die momentan angeboten werden.

 

 

Ease of use (protocol free)

Adhesion Ligand

Oligo-saccharide

Degradable

Cell recovery/ Trypsination

Chemical reaction free

Growth Factor storage/
release

Chemically-defined

Microscopy compatible

Suitable for Stem cell culture

Suitable for Cancer cell culture

Suitable for Primary cell culture

Suitable for screening

 

Fibronectin

           

ECM protein

Vitronectin

         

ECM protein

Osteopontin

               

ECM protein

Collagen (I,IV,etc)

            ▪  

ECM protein

Gelatin

             

ECM protein

Laminin

           

ECM protein

Biolamina, recombinant Laminin

     

ECM protein

3D MATRIX, puramatrix

               

Peptide nanofiber hydrogel

Pbiogelx, biogelx powder

               

Peptide nanofiber hydrogel

ESI-BIO, Hystem

           

Hyaluronate, collagen, Polyethylene glycol

Trevigen, cultrex

           

EHS tumor extract

East River BioSolutions, TissueSpec

           

Tissue-specific extracts

Ectica, 3DProSeed

               

Polymer

Corning, matrigel

           

EHS tumor extract

Corning, Synthemax

     

Vitronectin-derived peptide

Corning, Synthemax II

                 

Plastic microbeads coated with synthemax

Corning, Osteo-assay

               

Crystalline calcium phosphate

Corning, Ultra-low attachment

                 

hHdrophilic uncharged polymer surface

BRTI Life Sciences, Cell-Mate3D

           

Hyaluronate -Chitosan hydrogel

Pepgel, PGmatrix

               

Peptide hydrogel

Novamatrix, Novatach

             

RGD coupled alginate

Orla, OrlaExplorer-ECM

       

32 recombinant ECM proteins 

Cellendes, 3D-Life

             

Dextran PVA - PEG hydrogels

Amsbio, mimetix

               

PLLA electrospun fibres

Amsbio, iMatrix

       

E8 Fragment from laminin

Amsbio, MAPTrix

       

Recombinant chimeric ECM proteins

Amsbio, Alvetex

                   

Porous Polystyrene sheet

Noviocell, PIC hydrogel

               

Thermoreversible polyisocyanopeptide hydrogel

Organogenix, NanoCulture Plate

                 

Low adhesion patterned plates

Primorigen biosciences, StemAdhere

           

Recombinant protein, human origin

The well bioscience, Vitrogel 3D

             

Polysaccharide hydrogel, non-covalent crosslink

Thermofisher, Algimatrix

               

Alginate gels

Thermofisher, CELLstart

         

Human plasma extract

Thermofisher, Geltrex

         

EHS tumor extract

Lonza, RAFT

               

Collagen, RAFT (Real Architecture For 3D Tissue)

Global Cell Solutions, GEM

             

Alginate microcarrier ferromagnetic beads

InSphero, GravityPLUS

                   

Hanging drop ECM-free

DenovoMATRIX, screenMATRIX

 

Glycosaminoglycan PEG-Peptide biomatrix

Hersteller und Lieferanten
für Coatings und Beschichtungslösungen sowie gecoatetes Plastik

Logo denonvo_MATRIX denovoMATRIX
Produktionsort Deutschland
QMS Qualitätsmanagement ist an ISO 9001 angelehnt.
Produkte screenMATRIX:
Screening-Tool für die Identifizierung chemischer Beschichtungskomponenten für spezielle Zelltypen und spezielle wissenschaftliche Fragestellungen.
myMATRIX:
Standardisierte, beschichtete Zellkulturgefäße für die Expansion und Differenzierung spezieller Stammzelltypen.

Chemische Komponenten

Die Zusammensetzung der Beschichtungen ist vollständig chemisch definiert.

  • Glykosaminoglykane
  • Polyethylenglykol (PEG)
  • Polypeptide
Medien

Geeignete serumfreie Medien:

  • StemPro MSC SFM (Thermo Fisher)
  • PRIME-XV MSC Expansion SFM (Irvine Scientific)
  • Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF (PromoCell)

Geeignete serumhaltige Medien:

  • DMEM + 10 % FCS
  • αMEM  + 10 % FCS

Hinweis: Diese Beschichtung wurde speziell für die Verwendung mit serumfreien Medien entwickelt. Die Verwendung der Beschichtung in dieser Kombination bietet laut Hersteller erhebliche Vorteile.

 

Beschichtete Formate

96 Wellplatten:

screenMATRIX - Beschichtete Mikrotiterplatte mit 96 Wells. Jede Well enthält eine Variation einer chemisch definierten, modular zusammengesetzten Beschichtung.

6, 12, 24 Wellplatten:

myMATRIX - Standardmäßig werden diese beschichteten Formate angeboten.

T25, T75, T225 Zellkulturflaschen:

myMATRIX - Standardmäßig werden diese beschichteten Formate angeboten.

Sonderanfertigungen:

myMATRIX - Zweischicht-Zellfabriken bis Multischicht-Zellfabriken werden auf Nachfrage beschichtet.

Lagerung

Beschichtete Zellkulturgefäße werden trocken geliefert.

Das Produkt kann ungekühlt gelagert werden. Gekühlte Lagerung erhöht die Lagerfähigkeit um den Faktor 4.

Haltbarkeit

Lagerbar bei 37 °C für 6 Monate.

Lagerbar bei 4 °C für 24 Monate.

Preisniveau

Produkte liegen im oberen Preissegment.

Zelltypen

screenMATRIX

  • Primärzellen
  • Stammzellen

myMATRIX

  • Mesenchymale Stromazellen /mesenchymals Stammzellen (MSC)
  • Induzierte pluriopotente Stammzellen (iPSC)
GMP-Kompatibilität Eine GMP-Zertifizierung ist aufgrund chemischer Definiertheit grundsätzlich möglich (GMP-kompatibel).
Bekannte Vorteile
  • Ermöglicht serum-freie Zellkultur.
  • Stabilisierung von Wachstumsfaktoren im Medium erhöht laut Hersteller dessen Nutzbarkeit und verlängert die Zeit bis zum Medienwechsel.
  • Eine hohe Reproduzierbarkeit durch chemisch definierte Beschichtung im Vergleich zu Produkten tierischen Ursprungs.
  • Beschichtung ist zu 100 % optisch transparent und ist somit geeignet für Hochauflösungsmikroskopie, Spektrophotometrie und Platereader.

Bekannte Nachteile

  • Keine Anwendung in 3D-Applikationen.
  • Es liegt derzeit keine GMP-Zertifizierung vor.

Weitere Informationen

  • Die Haltbarkeit der Produkte beträgt ungekühlt 6 Monate und verlängert sich auf 24 Monate bei gekühlter Lagerung.

  • Längere Haltbarkeit des Nährmediums durch Stabilisierung von Wachstumsfaktoren an der Beschichtungsoberfläche.

  • Die Erstellung maßgeschneiderter Beschichtungen wird angeboten.

  • Spezifische Zelladhäsion wird erreicht über Integrine und Glykosaminoglykane.

  • Die Produkte können mit getesteten, serum-freien Medien verwendet werden.

Beschichtungsprotokoll

Die Produkte sind gänzlich protokollfrei.

Die Zellkulturgefäße sind vorbeschichtet und damit ohne weitere Vorbereitung einsatzbereit.

Kompatible Analysegeräte

Hochauflösende Mikroskope (Fluoreszenz, Phasenkontrast, Brightfield)

Platereader

Webseite

https://www.denovomatrix.com/products/screenmatrix

https://www.denovomatrix.com/products/mymatrix