Zellkultur-Plastik generelle Übersicht

Plastik ist gleich Plastik?

Möchte man denken, aber so ist es nicht!

Je nach Hersteller unterscheidet sich das Ausgangs-Material dieses Zellkultur-Verbrauchsmaterials zwar meist in der chemischen Zusammensetzung nicht (alle Zellkultur-Flaschen, Multiwells und Zellkultur-Schalen für adhärente Zellen sind aus Polystyrol und nur wenige haben Beimischungen aus z.B. Polyethylenterephthalat), aber die Bearbeitung, Modifikationen der Oberflächen und die Verunreinigungen unterschieden sich grundlegend. Auch die einzelnen Formate wie Zellkultur-Schalen, -Flaschen und -Multiwellplatten eines Herstellers können sich von einander unterscheiden. Zur Verbesserung der Anheftung bei adhärenten Zellen verwendet man in speziellen Fällen sogenannte Coatings (Beschichtungen).

Oberflächen-Eigenschaften für adhärente Zellen im Vergleich:

Polystyrol ohne weitere Modifikation ist als Zellkulturplastik zur Adhäsion von Zellen in Flaschen, Schalen und Multiwell-Platten nicht ausreichend, weil es zu hydrophob ist und die Zellen darauf schlecht adhärieren können. Daher behandeln alle Hersteller ihre Flaschen, Schalen und Multiwellplatten mit Plasma (ionisiertem Gas). Dadurch entstehen - je nach Hersteller und Rezept - folgende physikalisch-chemischen Oberflächenmodifikationen bei Zellkultur-Plastik:

• Aufrauung und Oberflächenvergrößerung durch physikalische Behandlung (rauhere Oberfläche)
• überwiegend positive Ladungen (z.B. Amine)
• überwiegend negative Ladungen (z.B. Carboxygruppen)
• positive und negative Ladungen
• polare Gruppen (z.B. Hydroxyl-, Amide, Ester, Carbonylgruppen)
• hydrophobe Oberflächen (für z.B. Suspensionszellen)

Wenn bei der Plasma- bzw. Corona-Behandlung etwas schief geht, minderqualitative Werkzeuge verwendet werden oder der Hersteller keine gute Qualitätskontrolle hat, dann kann dies dazu führen, dass Teile der Zellkultur-Flasche oder des Multiwells keine homogene Oberfläche aufweisen. Natürlich macht die Qualitätskontrolle gute Produkte auch etwas teurer, aber dafür haben wir weniger Variationen in unseren Kulturen und damit auch den Ergebnissen.

HeLa Zellen ca. 200x	HeLa Zellen ca. 200x

Oberflächen Homogenität Hersteller-Vergleich im Praxiskurs

In unserem Kurs Zellkultur Bioassays testen wir Platten unterschiedlicher Hersteller im praktischen Teil, damit sich die Teilnehmer selbst überzeugen können, wie groß die Unterschiede bei der Verdunstung und Homogenität sind. Einige Ergebnisse solcher Tests haben wir im Folgenden aufgeführt. Allerdings sind dies Teilnehmerergebnisse von Anfängern, es kommen also auch Misch- und Pipettierfehler als Faktoren für eine falsche Verteilung hinzu. HEK Zellen wurden in einer Dichte von 30.000 Zellen pro well ausplatiert (sehr hohe Zellzahl), einen Tag inkubiert und am nächsten Tag mit Kristallviolett gefärbt. Da die Zellen sich dabei blau bis violett anfärben, kann man sagen: je blauer desto mehr Zellen sind im well oder im Bereich des wells adhäriert. Keine der Platten war im Außenbereich befüllt, um den Edgeeffekt zu vermindern.

Kursergebnis: Platte 1	Kursergebnis: Platte 2	Kursergebnis: Platte 3

Multiwell-Platten, Belüftung, Verdunstung und Edgeeffekte

Ein weiterer Punkt - der bei der Auswahl von Multiwell-Platten oft übersehen wird - ist, dass die Konzipierung besonders von Zellkultur-Schalen und Multiwell-Platten die Anheftung und auch die generelle Verteilung von Zellen in den Wells oder in der Schale beeinflussen kann. In Multiwell-Platten ist dies im Vergleich besonders problematisch, weil meist die äußeren Wells völlig andere Messergebnisse bringen und damit die Standardabweichung des Assays stark vergrößert wird. Dies kann man wunderbar in den unten gezeigten Kristallviolettfärbungen von zwei 96er Platten sehen. Hierbei wurden einfach die ausplatierten Zellen fixiert und mittels Kristallviolett blau bzw. lila angefärbt. Je dunkler die Farbe, desto mehr Zellen sitzen in der jeweiligen Region. Die Bilder stammen aus unserem Bioassaykurs.

Kombination aus Oberflächen und Edgeeffekten	Kombination aus Oberflächen und Edgeeffekten

Wenn man Platten länger als zwei Tage im Inkubator stehen lässt, lässt sich die Verdunstung in den äußeren Wells bereits erkennen. Besonders deutlich wird die Verdunstung aber, wenn man die Platte für 5 Tage inkubiert. Ein Ergebnis eines solchen Tests sieht man in der Darstellung unten. Die verdunstete Flüssigkeit ist in % angegeben. Wenn man die Höhe der Verdunstung und die Muster in den unterschiedlichen Platten vergleicht, kann man sich vorstellen, wie stark die osmotischen Effekt sind, die die Zellen in den äußeren Wells beeinflussen.

Edgeeffekte als Verdunstung: Ergebnis aus einem Bioassaykurs

In vielen Bioassay-Laboren werden diese Effekte dadurch vermieden, dass die äußeren wells nicht genutzt werden. Dies bedeutet jedoch, dass ca. 30% der Platte "verschenkt" werden. Eine andere Variante ist, dass man eine Folie verwendet, die die Verdunstung verhindert. Dies hat aber auch Auswirkungen auf den Gasaustausch. Die dritte Variante ist die Verwendung einer Feuchtekammer, was jedoch recht aufwendig und kontaminationsfördernd ist. Eppendorf hatte seine Multiwell Platten so konzipiert, dass man zwei deutlich elegantere Varianten hat, um die Edgeeffekte zu verringern oder zu vermeiden. Wie man in den beiden Bildern unten sehen kann, besteht die Möglichkeit mit einmaligem Pipettieren den nur den äußeren Rand zu befüllen oder in einem zweiten Schritt zusätzlich den gesamten Interwell-Zwischenraum. Diese Befüllung setzt den Edgeeffekt fast vollständig herab. Die Daten stammen aus unserem Bioassaykurs. Leider hat Eppendorf die Produktion eingestellt, solche Platten gibt es somit derzeit nur von Nunc (Nunc Edge Platte).
Platten anderer Hersteller erlauben dies zum Teil gar nicht, weil die wells miteinander verbunden sind und man daher alle Zwischenräume einzeln befüllen müsste.

Eppendorf Multiwell: Füllung nur außen	Eppendorf Multiwell: Interspace gesamt gefüllt

Wer weitere Bilder oder Reports zu diesem Thema sucht, findet hier eine Studie von Thermo Scientific.

Verdunstungs-Schnellexperiment (Extrembedingungen) im Kurs

In unserem Kurs Zellkultur Bioassays testen wir Platten im praktischen Teil, damit sich die Teilnehmer selbst überzeugen können, wie groß die Unterschiede bei der Verdunstung und Homogenität sind. Einige Ergebnisse solcher Tests haben wir im Folgenden aufgeführt. In diesem - wegen der kurzen Dauer der Kurse - verkürzten Verdunstungsexperiment zeigt sich deutlich, dass die Platten unterschiedlich anfällig sind. Mit Abstand am besten haben hier die Eppendorfplatte (nicht mehr verfügbar) und die Nunc Edgeplatte mit befüllbarem Außenrand abgeschnitten. Die anderen Platten waren außen nicht befüllt, wären teilweise durch das Design aber auch nicht befüllbar.

Kursergebnis: Platte 1	Kursergebnis: Platte 2	Kursergebnis: Platte 3

Mikroskopierbarkeit von Multiwell-Platten

Ein weiterer Faktor der oft übersehen wird ist die Mikroskopierbarkeit von Zellen in Multiwell-Platten. Meist versucht man es gar nicht, weil man sowieso kaum etwas sehen. Allerdings hängt auch diese vom Hersteller und der Verarbeitung des Materials ab. Während die Planarität (Ebenheit) des Materials beeinflusst, ob man dauernd neu fokussieren muss, hängt die Sichtbarkeit und Mikroskopierbarkeit von Zellen vor allem in Multiwell-Platten auch davon ab, wie diese behandelt sind. Wie man in den Abbildungen sehen kann, bilden sich in nicht optimierten Platten in den wells tiefe Meniscen. Durch die veränderte Lichtbrechung kann man deshalb in den meisten Platten nur in einem sehr kleinen Bereich etwas sehen und meist auch eher unscharf. Durch eine optimierte Behandlung wie hier an Eppendorfplatten dargestellt, kann dies verhindert werden und die Zellen sind dann selbst in einer 96-well Platte gut zu mikroskopieren. Eppendorf produziert diese Platten leider nicht mehr, daher sollte man mehrere Hersteller testen. TPP und Nunc haben in unseren Tests auch ganz gut abgeschnitten.

Meniscen in Multiwells	Mikroskopierbarkeit in 96-well Platten

Weitere Bilder findet man bei "Wellplate" unter Bilder.

In unserem Kurs Zellkultur Bioassays testen wir Platten im praktischen Teil auch in Bezug auf die Mikroskopierbarkeit, damit sich die Teilnehmer selbst überzeugen können, wie groß die Unterschiede sind. Im Folgenden sind einige Bilder aus einem solchen Test dargestellt. Die oberen beiden Reihen zeigen Phasenkontrastaufnahmen der lebenden Zellen (HEK293) bei 400x. Die untere Reihe zeigt Kristallviolett-gefärbte HEK Zellen, ebenfalls bei 400x. Diese Bilder wurden mit einem Axiovert und einer MRC 5 von Zeiss gemacht. Das gute Mikroskop und die neue Kamera mit hoher Auflösung tragen natürlich auch zur Qualität der Bilder bei. Auch hier zeigt sich zwischen der Eppendorfplatte (3, nicht mehr verfügbar) und den beiden anderen Platten ein deutlicher Unterschied. Die Nunc Edge Platte hat ein in weiteren Kursen ebenfalls gut abgeschnitten.

Kursergebnis: Platte 1	Kursergebnis: Platte 2	Kursergebnis: Platte 3

Plastikware Herstellerwechsel

Bei einer Umstellung auf einen anderen Anbieter von Zellkultur-Flaschen, -Schalen oder -Multiwells sollte man also immer darauf achten, wie sich die Zellen auf dem neuen Plastik verhalten. Oft brauchen die Zellen auch etwas Zeit, um sich an eine neue Plastik-Oberfläche zu gewöhnen. Man sollte Ihnen also Adaptationszeit geben.

Außerdem ist es immer gut einen zweiten Lieferanten für alle Formate vorab zu testen, falls die eigentliche Bezugsquelle mal Lieferschwierigkeiten hat.

Flaschen und Multiwell-Platten von unterschiedlichen Herstellern

Außerdem sollte man überlegen, ob man nicht immer Schalen, Flaschen und Multiwells eines Anbieters kauft. Ansonsten müssen sich die Zellen beim Wechsel der Formate - also nach der Kultur in Flaschen bei der Umsetzung in Multiwells - erst auf die neue Oberfläche einstellen. Dies kann die Proliferationspause nach dem Umsetzen verlängern und die Assayergebnisse verändern.

Keinesfalls sollte man davon ausgehen, dass man die Stammkultur in unterschiedlichen Flaschen kultivieren kann, ohne Unterschiede in der Proliferationsrate zu erzeugen. Solche Wechsel sollten generell vermieden werden.

 

Beschichtung von Oberflächen der Plastikware (coating)

Zellkultur-Schalen und -Flaschen
für serumfreie oder animal-component-freie Zellkultur

Einige neue Oberflächenmodifikationen, die meist von den Herstellern nicht näher erläutert werden, scheinen die serumfreie Zellkultur zu unterstützen. Wenn man mit Serumersatz arbeitet, ergibt sich oft die Notwendigkeit Schalen und Flaschen für die Zellkultur zu beschichten (coating). Dies ist teurer und zeitintensiver. Das größte Problem ist jedoch, dass die Beschichtungsproteine meist wieder tierischer Herkunft sind oder als rekombinante Proteine extrem teuer. Im Bereich der TEP und ATMP lohnt es sich daher immer diese neuen Modifikationen zu testen (s.u.).

Schalen, Flaschen, Multiwell-Platten und Einwegreaktoren für Zellkultur unter GMP

Unter GMP sind die Ansprüche an das Zellkultur-Plastik höher. Man sollte immer einen zweiten Anbieter testen, damit man einen möglichen Ersatz hat, wenn der Erstanbieter mal Lieferschwierigkeiten haben sollte. Damit die Assays auch dann ohne Zeitverzögerung klappen, muss man vorher ein geeignetes Ausweichmaterial festgelegt haben.

Falls in der Zellkultur Zellen oder Gewebe produziert und kultiviert werden, die als ATMP (advanced therapy medicinal product) oder TEP (tissue engineering product) eingesetzt werden sollen, muss man sich auch mit sogenannten leachables und extractables, Pyrogenen, Biokompatibilität und dem Sterilitätslevel (SAL, sterility assurance level) befassen.

Aus dem Plastik können Stoffe austreten oder gelöst werden. Diese können von den Zellen oder Geweben aufgenommen und mit diesen dem Patienten zugeführt werden. Dies würde unter Umständen eine Schädigung auslösen. Daher gibt es auch hier Richtlinien und Grenzwerte. Gute Hersteller von qualitativ hochwertigem Plastik haben daher Zertifikate zu leachables und extractables. CE-gekennzeichnete oder für IVF-zugelassene Plastikware ist bisher meist unbehandelt und für adhärente Zellen daher nicht gut geeignet.

Anbieter von Zellkultur-Plastikware

Es gibt zahlreiche Anbieter von Zellkultur-Plastik. Hier gilt: das teuerste Zellkulturplastik muss nicht immer auch für Ihre Linie oder Ihre Primärzellen das Beste sein. Ausprobieren lohnt sich bei Primärzellen immer, bei Zelllinien kann man mit dem Plastik, das man schon im Labor hat, anfangen und testet nur, wenn man damit Probleme hat bzw. um einen Back-up Lieferanten zu finden.

Für Zellkultur unter GMP sollte man immer darauf achten, einen Anbieter zu wählen, der möglichst in Europa produziert, weil hier meist höhere Qualitätsstandards angelegt werden und man sich so unangenehme Überraschungen erspart.

Kurzübersicht Anbieter

In der letzten Spalte ist als Vergleichsgrundlage der Preis für 1 Zellkulturflasche 75cm² in der kleinsten Verpackungseinheit mit Oberfläche für adhärente Zellen, Schräghals, mit Filterdeckel angegeben, soweit wir diese erhalten haben. Alle Preise sind unverbindliche Listenpreise (Stand 2017-05).

PHCbi (ehemals Panasonic, Sanyo)

TPP (über Faust Lab Science in Deutschland)

Greiner Bio-one

BRAND

Eppendorf

Traurigerweise hat Eppendorf 2020 die Produktion von Zellkulturplastik, also Flaschen, Schalen und den super tollen Multiwellplatten eingestellt. Bedauerlich!

Nunc (Thermo Scientific)

BD