Zellkultur Bioassays - cell-based assays Überblick

Hintergrund

Bioassays oder cell-based assays sind experimentelle Verfahren zur Bestimmung der biologischen Wirkung von Substanzen auf lebende Systeme wie Zellen, Gewebe oder Organismen. Im Gegensatz zu rein chemischen Analysen erfassen sie funktionelle Effekte und liefern damit biologisch relevante Informationen. Sie sind sowohl in der Forschung als auch im Pharmabereich z.B. als Freigabeassays (release assays) im Bereich GMP mittlerweile unersetzlich. Vor allen Wirksamkeitsprüfungen (potency assays) sind häufig cell-based assays.

Es gibt verschiedenste Arten von Bioassays die grundlegend (Zellzahl, Zelltod, Metabolismus) oder spezifisch (bestimmte Rezeptoren, Kaskaden) sein können. Die Auswertung kann über Absorption, Fluoreszenz, Lumineszenz, Mikroskopie oder Impedanz erfolgen. Manche Assays sind sogenannte Endpunktassays, andere sind kontinuierlich. Auf dieser Seite versuchen wir einen Überblick über Vor- und Nachteile von verschiedenen Assaytypen, Messprinzipien und speziellen Assays zu geben.

Zellkultur Bioassays (Basis bis GMP) plates 96 well

Wo und wofür werden Bioassays verwendet

Typische Anwendungsgebiete sind:

Pharmaforschung und Wirkstoffentwicklung
- Identifikation und Charakterisierung neuer Wirkstoffe
- Bestimmung von Wirksamkeit (Potenz, EC50/IC50)
- Toxizitätsscreening
Toxikologie und Sicherheitsbewertung
- Bewertung von Chemikalien, Umweltgiften und Kosmetika
- Risikobewertung für Mensch und Umwelt
Biotechnologie und Qualitätskontrolle
- Prüfung biologischer Produkte (z. B. Antikörper, Impfstoffe)
- Chargenkontrolle und Stabilitätsuntersuchungen
Grundlagenforschung
- Untersuchung zellulärer Signalwege
- Analyse von Zellverhalten (Wachstum, Differenzierung, Tod)

Arten von Bioassays: Endpunkt vs. kontinuierliche Assays

Bioassays lassen sich grundsätzlich in zwei Kategorien einteilen:

Endpunkt-Assays
Kontinuierliche (kinetische) Assays

Endpunkt-Assays

Endpunkt-Assays messen die biologische Antwort zu einem definierten Zeitpunkt.

Eigenschaften:

Messung erfolgt einmalig nach Inkubation
Einfach durchzuführen und gut standardisierbar
Oft hohe Reproduzierbarkeit

Beispiele:

WST-8, WSt-1; XTT- und MTT-Assay
Neutral Rot, Kristallviolett Assays
LDH- oder Protease-Freisetzungsassay
Caspase-Endpunktmessung

Vorteile:

Geringer technischer Aufwand
Hoher Durchsatz (High-Throughput-Screening geeignet)

Nachteile:

Keine Information über zeitliche Dynamik
Kritisch bei zeitabhängigen Prozessen

Kontinuierliche (kinetische) Assays

Diese Assays erfassen die biologische Reaktion über einen Zeitraum hinweg kontinuierlich bzw. sehr engmaschig.

Eigenschaften:

Mehrfache Messung desselben Samples über die Zeit (Kinetik)
Echtzeit- oder zeitaufgelöste Daten

Beispiele:

Live-Cell Imaging
Impedanzbasierte Zellanalyse (z. B. xCELLigence)
Fluoreszenz-Reporter-Assays

Vorteile:

Darstellung von Dynamiken (z. B. Wachstumskurven)
Höhere Informationsdichte

Nachteile:

Höherer technischer Aufwand
Datenanalyse komplexer

Assays zur Bestimmung der Zellzahl

Zellzahlassays dienen der Quantifizierung lebender oder gesamter Zellen in einer Probe. Sie basieren auf unterschiedlichen biologischen oder physikalischen Prinzipien. Die Zellzählung ist hier am präzisesten, aber auch sehr aufwendig. Andere Assays ermitteln die Zellzahl indirekt, was fehleränfällig ist.

Übersicht der Assaytypen und Prinzipien

Assaytyp	Beispiel	Prinzip
Zellzählung	Zellzählung im Counter, Trypan Blau, Eosin B	Direkte und damit präziseste Methode. Zellen werden im Counter gezählt. Lebende und tote Zellen können durch Farbstoffe unterschieden werden.
Metabolische Aktivität	MTT, XTT, WST-1, WST-8, Resazurin (Alamar Blue)	Indirekte Messung. Reduktion von Farbstoffen durch mitochondriale oder cytoplasmatische Enzyme in lebenden Zellen. Die metabolische Aktivität korreliert mit der Zellzahl.
Membranintegrität der Lysosomen	Neutral Rot	Indirekte Messung. NR wird in die Zellen aufgenommen und durch den niedrigen pH in den Lysosomen zurückgehalten. Die Zellzahl korreliert mit der Farbstoffmenge
ATP-basierte Assays	CellTiter-Glo	Indirekte Messung. Lumineszenz proportional zur ATP-Konzentration als Maß für lebende Zellen
DNA-Menge	Hoechst, PicoGreen	Direkte Messung. Fluoreszenzfarbstoffe binden an DNA → proportional zur Zellzahl
Proteinquantifizierung	SRB (Sulforhodamin B)	Indirekte Messung, Bindung an Zellproteine → Gesamtzellmasse
Impedanzmessung	Real-Time Cell Analysis	Indirekte Messung. Änderung des elektrischen Widerstands durch adhärente Zellen
Bildbasierte Verfahren	Mikroskopie + Software	Direkte Zellzählung über Bildanalyse

Cytotoxizitätsassays

Cytotoxizitätsassays messen die Reduktion lebender oder die Zunahme toter Zellen, um das toxische Potential von Substanzen zu ermitteln.

Übersicht der Assaytypen und Prinzipien

Assaytyp	Beispiel	Prinzip
Zellzählung	Trypan Blau, Eosin B; Zellzählung im Counter	Direkte und damit präziseste Methode. Zellen werden im Counter gezählt. Lebende und tote Zellen können durch Farbstoffe unterschieden werden.
Metabolische Aktivität	MTT, XTT, WST-1, WST-8, Resazurin (Alamar Blue)	Indirekte Messung. Reduktion von Farbstoffen durch mitochondriale oder cytoplasmatische Enzyme in lebenden Zellen. Die metabolische Aktivität korreliert mit der Zellzahl.
Membranintegrität der Lysosomen	Neutral Rot	Indirekte Messung. NR wird in die Zellen aufgenommen und durch den niedrigen pH in den Lysosomen zurückgehalten. Die Zunahme toter Zellen korreliert mit NR im Medium.
LDH-Freisetzung	LDH-Assay	Indirekte Messung. Sterbende Zellen setzen LDH frei. Die Aktivität von LDH (Laktatdehydrogenase) im Medium kann gemessen werden.
ATP-Abnahme	CellTiter-Glo	Indirekte Messung. Abnahme von ATP zeigt Zellsterben

Proliferationsassays

Proliferationsassays messen die Zunahme lebender Zellen, um das proliferationsfördernde Potential von Substanzen zu ermitteln.

Übersicht der Assaytypen und Prinzipien

Assaytyp	Beispiel	Prinzip
Zellzählung	Trypan Blau, Eosin B; Mikroskopie, Zellzählung über automatisierte Counter	Direkte und damit präziseste Methode. Zellen werden im Counter gezählt. Lebende und tote Zellen können durch Farbstoffe unterschieden werden. Bei Mikroskopen manhmal schwierig, wenn die Zellen kontrastarm sind
DNA-Synthese	BrdU, EdU	Direkter Assay, präzise, Einbau in neu synthetisierte DNA, damit wird die tatsächliche Proliferation über die Rate an DNA-Synthese gemessen
Klonogenität	Colony Formation Assay	Direkte Messung. Fähigkeit zur Bildung von Zellkolonien
Metabolische Aktivität	MTT, XTT, WST-1, WST-8, Resazurin (Alamar Blue)	Indirekte Messung. Reduktion von Farbstoffen durch mitochondriale oder cytoplasmatische Enzyme in lebenden Zellen. Die metabolische Aktivität korreliert mit der Zellzahl.
Membranintegrität der Lysosomen	Neutral Rot	NR wird in die Zellen aufgenommen und durch den niedrigen pH in den Lysosomen zurückgehalten. Die Zunahme toter Zellen korreliert mit NR im Medium.
LDH-Freisetzung	LDH-Assay	Sterbende Zellen setzen LDH frei. Die Aktivität von LDH (Laktatdehydrogenase) im Medium kann gemessen werden.
ATP-Abnahme	CellTiter-Glo	Abnahme von ATP zeigt Zellsterben

Apoptoseassays / Zelltod

Apoptoseassays messen die Zunahme toter Zellen oder spezifische Endpunkte, die für Apoptose spezifisch sind, um das cytotoxische Potential von Substanzen zu ermitteln.

Übersicht der Assaytypen und Prinzipien

Assaytyp	Beispiel	Prinzip
Zellzählung	Trypan Blau, Eosin B; Mikroskopie, Zellzählung über automatisierte Counter	Direkte und damit präziseste Methode. Detektiert Zelltod, nicht nur Apoptose. Zellen werden im Counter gezählt. Lebende und tote Zellen können durch Farbstoffe unterschieden werden. Bei Mikroskopen manhmal schwierig, wenn die Zellen kontrastarm sind
Caspase-Aktivität	Caspase-3/7 Assay	Direkter Assay. Detektiert nur Apoptose, nicht Nekrose. Aktivierung von Apoptose-Enzymen
Membranveränderung	Annexin V	Direkter Assay. Detektiert nur Apoptose, nicht Nekrose. Bindung an exponiertes Phosphatidylserin
DNA-Fragmentierung	TUNEL	Direkter Assay. Detektiert nur Apoptose, nicht Nekrose. Nachweis fragmentierter DNA (DNA-Leiter), die für Apoptose typisch ist.
Mitochondrien	JC-1, TMRE	Indirekter Assay. Veränderung des Membranpotentials im Mitochorndrien ist der Endpunkt.
Zellmorphologie	Mikroskopie	Indirekte Methode. Schrumpfung, Membranblebbing werden detektiert.
Membranintegrität der Lysosomen	Neutral Rot	Indirekter Assay, detektiert Zelltod, nicht nur Apoptose. NR wird in die Zellen aufgenommen und durch den niedrigen pH in den Lysosomen zurückgehalten. Die Zunahme toter Zellen korreliert mit NR im Medium.
LDH-Freisetzung	LDH-Assay	Indirekter Assay, detektiert Zelltod, nicht nur Apoptose. Sterbende Zellen setzen LDH frei. Die Aktivität von LDH (Laktatdehydrogenase) im Medium kann gemessen werden.
ATP-Abnahme	CellTiter-Glo	Indirekter Assay, detektiert Zelltod, nicht nur Apoptose. Abnahme von ATP zeigt Zellsterben

Vergleich von Assaysystemen

Assay	Vorteile	Nachteile	Sensitivität	Kosten	HTS geeignet
WST-8	Einfach, wasserlöslich, Phenolrot stört nicht, wenig cytotoxisch, sehr sensitiv, besser als WST-1, XTT, MTT	Endpunkt	Hoch	Mittel	Ja
WST-1	Einfach, wasserlöslich, weniger sensitiv als WST-8, cytotoxischer als WST-8	Weniger sensitiv als ATP	Mittel	Niedrig–mittel	Ja
MTT	Robust, weit verbreitet, günstig	Endpunkt, toxisch, wasserunlösliches Endprodukt muss aufgelöst werden, mehr Schritte als WST-8	Mittel	Niedrig	Nein
Resazurin (Alamar Blue)	Nicht-toxisch, kinetisch messbar	Signal abhängig vom Zelltyp	Mittel–hoch	Niedrig	Ja
LDH-Assay	Einfach, schnell	Hintergrundsignal möglich	Mittel	Niedrig	Ja
Trypan Blue	Direkt, einfach	Manuell, schlecht automatisierbar	Niedrig	Niedrig	Nein
BrdU	Etabliert, spezifisch	DNA-Denaturierung nötig	Hoch	Mittel	Eingeschränkt
EdU	Schnell, keine Denaturierung	Teurer	Hoch	Mittel–hoch	Ja
CellTiter-Glo (ATP)	Sehr sensitiv, schnell	Zelllyse nötig, kein Live-Monitoring	Hoch	Hoch	Ja
Colony Formation	Goldstandard Langzeitwirkung	Sehr zeitaufwendig	Hoch	Niedrig	Nein
Caspase 3/7	Spezifisch für Apoptose	Nur Teil des Prozesses	Hoch	Mittel	Ja
Annexin V	Frühmarker	Kombination mit PI nötig	Hoch	Mittel	Eingeschränkt
TUNEL	Direkte DNA-Fragmentierung	Kann Nekrose mitmessen	Hoch	Mittel–hoch	Eingeschränkt
JC-1 / TMRE	Frühe mitochondrale Effekte	Sensitiv gegenüber Bedingungen	Mittel	Mittel	Eingeschränkt
Hoechst / PicoGreen	Direkt DNA-basiert, stabil	Misst auch tote Zellen	Hoch	Mittel	Ja
SRB	Sehr reproduzierbar	Mehr Schritte (Fixierung)	Mittel	Niedrig	Eingeschränkt
xCELLigence (Impedanz)	Echtzeit, label-free	Teure Geräte	Mittel	Sehr hoch	Nein
Live-Cell Imaging	Viele Parameter gleichzeitig	Datenanalyse komplex, klappt nicht mit allen Zellen, Software-abhängig	Hoch	Sehr hoch	Eingeschränkt