Zellkultur Bioassays - cell-based assays Überblick
Hintergrund
Bioassays oder cell-based assays sind experimentelle Verfahren zur Bestimmung der biologischen Wirkung von Substanzen auf lebende Systeme wie Zellen, Gewebe oder Organismen. Im Gegensatz zu rein chemischen Analysen erfassen sie funktionelle Effekte und liefern damit biologisch relevante Informationen. Sie sind sowohl in der Forschung als auch im Pharmabereich z.B. als Freigabeassays (release assays) im Bereich GMP mittlerweile unersetzlich. Vor allen Wirksamkeitsprüfungen (potency assays) sind häufig cell-based assays.
Es gibt verschiedenste Arten von Bioassays die grundlegend (Zellzahl, Zelltod, Metabolismus) oder spezifisch (bestimmte Rezeptoren, Kaskaden) sein können. Die Auswertung kann über Absorption, Fluoreszenz, Lumineszenz, Mikroskopie oder Impedanz erfolgen. Manche Assays sind sogenannte Endpunktassays, andere sind kontinuierlich. Auf dieser Seite versuchen wir einen Überblick über Vor- und Nachteile von verschiedenen Assaytypen, Messprinzipien und speziellen Assays zu geben.
Wo und wofür werden Bioassays verwendet
Typische Anwendungsgebiete sind:
- Pharmaforschung und Wirkstoffentwicklung
- Identifikation und Charakterisierung neuer Wirkstoffe
- Bestimmung von Wirksamkeit (Potenz, EC50/IC50)
- Toxizitätsscreening
- Toxikologie und Sicherheitsbewertung
- Bewertung von Chemikalien, Umweltgiften und Kosmetika
- Risikobewertung für Mensch und Umwelt
- Biotechnologie und Qualitätskontrolle
- Prüfung biologischer Produkte (z. B. Antikörper, Impfstoffe)
- Chargenkontrolle und Stabilitätsuntersuchungen
- Grundlagenforschung
- Untersuchung zellulärer Signalwege
- Analyse von Zellverhalten (Wachstum, Differenzierung, Tod)
Arten von Bioassays: Endpunkt vs. kontinuierliche Assays
Bioassays lassen sich grundsätzlich in zwei Kategorien einteilen:
- Endpunkt-Assays
- Kontinuierliche (kinetische) Assays
Endpunkt-Assays
Endpunkt-Assays messen die biologische Antwort zu einem definierten Zeitpunkt.
Eigenschaften:
- Messung erfolgt einmalig nach Inkubation
- Einfach durchzuführen und gut standardisierbar
- Oft hohe Reproduzierbarkeit
Beispiele:
- WST-8, WSt-1; XTT- und MTT-Assay
- Neutral Rot, Kristallviolett Assays
- LDH- oder Protease-Freisetzungsassay
- Caspase-Endpunktmessung
Vorteile:
- Geringer technischer Aufwand
- Hoher Durchsatz (High-Throughput-Screening geeignet)
Nachteile:
- Keine Information über zeitliche Dynamik
- Kritisch bei zeitabhängigen Prozessen
Kontinuierliche (kinetische) Assays
Diese Assays erfassen die biologische Reaktion über einen Zeitraum hinweg kontinuierlich bzw. sehr engmaschig.
Eigenschaften:
- Mehrfache Messung desselben Samples über die Zeit (Kinetik)
- Echtzeit- oder zeitaufgelöste Daten
Beispiele:
- Live-Cell Imaging
- Impedanzbasierte Zellanalyse (z. B. xCELLigence)
- Fluoreszenz-Reporter-Assays
Vorteile:
- Darstellung von Dynamiken (z. B. Wachstumskurven)
- Höhere Informationsdichte
Nachteile:
- Höherer technischer Aufwand
- Datenanalyse komplexer
Assays zur Bestimmung der Zellzahl
Zellzahlassays dienen der Quantifizierung lebender oder gesamter Zellen in einer Probe. Sie basieren auf unterschiedlichen biologischen oder physikalischen Prinzipien. Die Zellzählung ist hier am präzisesten, aber auch sehr aufwendig. Andere Assays ermitteln die Zellzahl indirekt, was fehleränfällig ist.
Übersicht der Assaytypen und Prinzipien
|
Assaytyp |
Beispiel |
Prinzip |
| Zellzählung | Zellzählung im Counter, Trypan Blau, Eosin B | Direkte und damit präziseste Methode. Zellen werden im Counter gezählt. Lebende und tote Zellen können durch Farbstoffe unterschieden werden. |
|
Metabolische Aktivität |
MTT, XTT, WST-1, Resazurin (Alamar Blue) |
Reduktion von Farbstoffen durch mitochondriale Enzyme in lebenden Zellen. Die metabolische Aktivität korreliert mit der Zellzahl. |
| Membranintegrität der Lysosomen | Neutral Rot | NR wird in die Zellen aufgenommen und durch den niedrigen pH in den Lysosomen zurückgehalten. Die Zellzahl korreliert mit der Farbstoffmenge |
|
ATP-basierte Assays |
CellTiter-Glo |
Lumineszenz proportional zur ATP-Konzentration als Maß für lebende Zellen |
|
DNA-Menge |
Hoechst, PicoGreen |
Fluoreszenzfarbstoffe binden an DNA → proportional zur Zellzahl |
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Proteinquantifizierung |
SRB (Sulforhodamin B) |
Bindung an Zellproteine → Gesamtzellmasse |
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Impedanzmessung |
Real-Time Cell Analysis |
Änderung des elektrischen Widerstands durch adhärente Zellen |
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Bildbasierte Verfahren |
Mikroskopie + Software |
Direkte Zellzählung über Bildanalyse |
Cytotoxizitätsassays
Cytotoxizitätsassays messen die Reduktion lebender oder die Zunahme toter Zellen, um das toxische Potential von Substanzen zu ermitteln.
Übersicht der Assaytypen und Prinzipien
|
Assaytyp |
Beispiel |
Prinzip |
| Zellzählung | Trypan Blau, Eosin B; Zellzählung im Counter | Direkte und damit präziseste Methode. Zellen werden im Counter gezählt. Lebende und tote Zellen können durch Farbstoffe unterschieden werden. |
|
Metabolische Aktivität |
MTT, XTT, WST-1, Resazurin (Alamar Blue) |
Reduktion von Farbstoffen durch mitochondriale Enzyme in lebenden Zellen. Die metabolische Aktivität korreliert mit der Zellzahl. |
| Membranintegrität der Lysosomen | Neutral Rot | NR wird in die Zellen aufgenommen und durch den niedrigen pH in den Lysosomen zurückgehalten. Die Zunahme toter Zellen korreliert mit NR im Medium. |
| LDH-Freisetzung | LDH-Assay | Sterbende Zellen setzen LDH frei. Die Aktivität von LDH (Laktatdehydrogenase) im Medium kann gemessen werden. |
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ATP-Abnahme |
CellTiter-Glo |
Abnahme von ATP zeigt Zellsterben |