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Mykoplasmen-Kontaminationen in der Zellkultur

Mykoplasmen sind zusammen mit Kreuz-Kontaminationen die beiden schlimmsten Probleme, die wir in der Zellkultur haben. Darüber hinaus sind Mykoplasmen aber wahrscheinlich die hinterhältigsten mikrobiologischen Zellkultur-Kontaminationen, die wir kennen!

Warum ?

  • Weil man sie im Lichtmikroskop nicht sehen kann,
  • weil die Zellen nicht so schnell "umbringen" wie andere Bakterien,
  • weil sie in vielen Zelllinien schon Jahrzehnte vorhanden sind und
  • weil sie jeden Tag mit uns ins Zellkulturlabor gelangen.

Das schlimmste an Mykoplasmen ist jedoch, dass sie es schaffen, Zellkultivierer davon zu überzeugen, dass nur andere sie haben und sie sie anhaltend ignorieren. Anfragen bei Zellkultur-Nutzern durch verschiedene Zellbanken ergaben, dass momentan nur ca. 30% der Zellkulturlabore auf Mykoplasmen testen und die wenigsten testen regelmäßig. Daher ist es allerdings nicht erstaunlich, dass die Kontaminationsraten je nach Labor zwischen 4 und 90% liegen.

Dass das keine gute Idee ist, wollen wir hier gerne deutlich machen, indem wir beschreiben, was Mykoplasmen sind und wie man sie erkennen kann. Weitere Hilfestellung bekommen Sie auch in unseren Kursen Kontaminationsvermeidung, Aseptik und Hygiene, Qualitätsmanagement sowie Mykoplasmennachweis und Eliminierung.

Zellkultur mit Mycoplasmen-Kontamination

Die folgenden Themen finden Sie auf dieser Seite:

Mykoplasmen-Einordnung

Auswirkungen auf Zellkulturen

Verbreitung von Mykoplasmen

Ursprung von Mykoplasmen-Kontaminationen

Mykoplasmen-Nachweis-Methoden

Mykoplasmen-Nachweis Kits

Anforderungen der EuPharm

Zellkultur-Mykoplasmenspezies

 

Mykoplasmen-Einordnung

Mykoplasmen sind Bakterien und gehören zur Klasse der Mollicutes (Weichhäuter), weil sie natürlicherweise keine Zellwand ausbilden. Früher nannte man sie auch PPLO (pleuropneumonia-like organisms), dieser Begriff wird heute jedoch nur noch selten verwendet.

Da Mykoplasmen keine Zellwand ausbilden, sind sie vollkommen resistent gegen die Antibiotika, die wir normalerweise in der Zellkultur einsetzen, also z.B. Penicillin, Streptomycin, Gentamycin etc.

Außerdem bewirkt die fehlende Zellwand, dass Mykoplasmen 0,2µm Membranfilter passieren können. Der aufgebrachte Druck drückt die sich verformenden Mykoplasmen durch die Poren, auch wenn sie eigentlich größer als 0,2 µm sind!

Mycoplasmenund Bakterien Vergleich

Auswirkungen auf Zellkulturen

Mykoplasmen sind Parasiten! D.h. sie nehmen zum einen Nährstoffe aus dem Zellkulturmedium auf, aber sie entziehen den Zellen auch weitere Stoffe, die sie nicht selbst herstellen können. Darüber hinaus produzieren sie jedoch auch noch Toxine, die die Zellen  zusätzlich schädigen. Hier eine Liste der nachgewiesenen Effekte.

  • Hemmung der Zellproliferation durch Nährstoffentzug
  • Abfall des pH-Werts im Medium durch schnellen Glucose-Abbau
  • Arginin-Verarmung und dadurch Hemmung der Protein-Biosynthese
  • Hemmung der Differenzierung
  • Aktivierung von Immunzellen (Lymphocyten)
  • Veränderung der Membraneigenschaften
  • Veränderung des Protein-Expressionsprofils
  • Einzelne Spezies können scheinbar die Zellen penetrieren
  • Können Chromosomen-Abberationen verursachen
  • Verringern die Virenproduktion in Produktionslinien

 

Verbreitung von Mykoplasmen-Kontaminationen in Zellkulturen

Die internationalen Zellbanken, allen voran die DSMZ, testen regelmäßig die Zelllinien, die ihnen zugeschickt werden und publizieren die Ergebnisse. Hier einige der Ergebnisse in Kurzform.

  • Im Test durch Zellbanken werden im Durchschnitt 15-35% kontaminierte Kulturen ermittelt
  • Manche Studien zeigen sogar eine Rate von bis zu 80%
  • In industriellen Produktions-Kulturen kommen weniger Mykoplasmen vor als in Forschungskulturen
  • Wer nicht testet hat meist Mykoplasmen und dann auch in vielen Kulturen, wer testet hat meist keine (mehr)
  • Nur 30-50% der Forschungs-Labore testen auf Mykoplasmen
  • Nur < 20% der Forschungs-Labore testen regelmäßig

 

Ursprung von Mykoplasmen-Kontaminationen

Mykoplasmen-Kontaminationen fallen generell in 2 Kategorien: a) direkte und b) indirekte Kontamination. Unter direkten Kontaminationen versteht man, dass kontaminierte Lösungen zu den Zellen gegeben werden (z.B. FCS, Wachstumsfaktoren, Coating-Proteine). Indirekte Kontaminationen kommen meist durch Fehler in der sterilen Arbeitstechnik oder durch mangelnde Qualitätskontrolle zu Stande.

  • Durch mangelnde Hygiene werden menschliche Mykoplasmen auf Handschuhe oder Pipetten übertragen und gelangen von dort durch weitere Fehler in die Kultur
  • Mykoplasmen werden beim gleichzeitigen bearbeiten von einer Kultur auf eine andere übertragen
  • Mykoplasmen überleben in Medientröpfchen ca. 6 Wochen bei RT
  • Mykoplasmen können im Stickstofftank von einem Kryoröhrchen auf andere übertragen werden

 

Mykoplasmen-Nachweis-Methoden

Unter den Nachweis-Methoden für Mykoplasmen gibt es zwei besonders empfehlenswerte. Zum einen ein schneller und einfacher Nachweis mit DAPI oder Hoechst-Farbstoffen und zum zweiten der sensitive und günstige Nachweis über PCR. Hier sind zwei Beispiele dargestellt, wie man z.B. eine neue Charge von FCS testen kann.

Im ersten Beispiel wird das zu testende Reagenz (hier z.B. eine neue FCS Charge) zu einer sauberen Zellkultur gegeben und diese 7 Tage damit kultiviert (länger ist natürlich sicherer). Danach wird mit einem kommerziellen Kit der Zellkultur-Überstand mittels PCR getestet.

 

Zellkultur Mycoplasmen-Nachweis PCR

Images from InCelligence, Eppendorf AG, PromoCell GmbH and F. Timm Seabra Souza

 

Im zweiten Beispiel geht man identisch vor, allerdings fixiert man die Zellen am Ende und färbt sie mit DAPI oder Hoechst. Nun kann man eventuelle Mykoplasmen-Kontaminationen im Fluoreszenz-Mikroskop erkennen. Dieser Nachweis ist allerdings deutlich weniger sensitiv als die PCR. Wer diese Methode als einzige nutzen möchte, sollte immer eine Inkubationszeit von mindestens 14-21 Tagen einhalten.

 

 

Zellkultur Mycoplasmen-Nachweis DAPI

Images from InCelligence, Eppendorf AG, PromoCell GmbH and F. Timm Seabra Souza

 

Mykoplasmen-Nachweis-Kits PCR - Video-Demo

Firma Bemerkungen: Research kits
Beispiel-Video

 

Mycoplasma Test-Kit IC Mycoplasma Test-Kit IC

In unserem MOOC haben wir einKit benutzt, um in einem Video zu demonstrieren wie eine PCR funktioniert. Dieses Kit gibt es leider nicht mehr, aber die Methode beleibt ja gleich.

Ergebnis Beispiele:

Mykoplasmen PCR Gel Mycoplasmen PCR Gel

Legende PCR gel links:
Detection of mycoplasmas with PCR Mycoplasma Test Kit I/C. Left to right: 100 bp DNA ladder; Positive control; 10; 100; 1,000; 10,000; 100,000; 1000,000 mycoplasmas/sample volume. Internal control DNA: 479 bp band; Positive sample/control: 270 bp band.

Legende PCR gel rechts:
Detection of mycoplasmas with PCR Mycoplasma Test Kit I/C (image kindly provided by a customer). Left to right: DNA ladder; Test Samples (lanes 1-12);  Internal/Negative Control (lane 13); Positive Control (lane 14).

 

Mykoplasmen-Nachweis-Kits PCR - Pharma-Niveau (Freigabeprüfungen, validiert)

Firma Methode/NWG/GMP Spezies Preis Bemerkungen: Pharma-Kits
Greiner BioOne

PCR- Mikroarray

<10 KBE

GMP: +

alle (ja/nein), (EuPharm 9 von 7-9)
40 (identifiziert)
>560

Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: ja
Pharma-Kit
 geeignet zur Freigabeprüfung. Hat alle Kontrollen und identifiziert 40 Mykoplasmen aus Artniveau zur schnellen Identifikation der Kontaminationsquelle. Darüber hinaus ist eine Universalsonde vorhanden, die alle anderen Mykoplasmenspezies detektiert, die bisher bekannt sind. Aber es sind spezielle Geräte notwendig, die gekauft werden müssen. Das System wird bereits in der Pharmaindustrie eingesetzt.
CytoinspectTM

Roche

PCR-Gel

<10 KBE

GMP: +

alle (ja/nein), (EuPharm ? von 7-9) >500

Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: ja

Dieses Pharma-Kit nutzt eine Universalsonde und wirft damit am Ende nur ein Ja/Nein Ergebnis aus. Dafür sind allerdings nur gängige Geräte notwendig, die jedoch ebenfalls qualifiziert werden müssen. Das Kit wurde von Genentech entwickelt und wird bei Roche auch schon mit EMEA approval für Pharmaprüfungen verwendet.
MycoTool

* Price is price/sample when purchasing a normal size kit including all reagents.

 

Mykoplasmen-Nachweis-Kits PCR - Forschung und Pharma-QK

Firma Methode/NWG/GMP Spezies Preis Bemerkungen: Research kits
Sartorius

qPCR

keine Angabe

GMP: -

Semi-quantitativ
  • M. orale, M. arginini, M. hyorhinis, A. laidlawii, M. fermentans, M. pneumoniae, M. synoviae, (EuPharm 7 von 7-9)
  Validiert nach EP 2.6.7 für: sensitivity, specificity, and robustness. Erfüllt auch Kriterien der USP und JP.
Southern Biotech

PCR

1000-2500 KBE

GMP: -

20 (ja/nein) =
  • M. orale, M. arginini, M. hyorhinis, A. laidlawii, M. fermentans, M. pneumoniae, M. synoviae, (EuPharm 7 von 7-9)
  • M. hominis, M. penetrans, M. pirum, U. urealyticum, M. falconis, M. arthritidis, M. opalescens, M. bovis, M. cloacale, M. hyosynoviae, M. salivarium, M. faucium, M. genitalium
  Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: ja
Minerva

PCR-Gel

<1000-2500 KBE

GMP: -

28 (ja/nein) = 
  • M. orale, M. arginini, M. hyorhinis, A. laidlawii, M. fermentans, M. pneumoniae, M. synoviae, (EuPharm 7 von 7-9)
  • M. hominis, M. pirum, U. urealyticum, M. pulmonis, M. falconis, M. arthritidis, M. spermatophilum, M. opalescens, M. primatum, M. maculosum, M. bovis, M. cloacale, M. hyosynoviae, M. salivarium, M. faucium, M. genitalium, M. bovigenitalium, M. sp. ovine/caprine, M. agalactica, M. timone
<10,34 Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: ja

Dieser Kit stellt eine methodische Vereinfachung dar. Die Tubes enthalten bereits Nukleotide, der MasterMix ist fertig und enthält auch schon Ladepuffer. Damit entfallen viele Pipettierschritte. Außerdem ist die Positivkontrolle in eigenen Tubes vorgelegt, sodass seltener Kontaminationen vorkommen. 4 Pipettierschritte insg. 
VenorGeM Advance
Sigma

PCR-Gel

<1000-2500 KBE

GMP: -

19 (ja/nein) = 
  • M. arginini, A. laidlawii, M. orale, M. fermentans, M. hyorhinis, (EuPharm 5 von 7-9)
  • M. salivarium, M. hominis, M. agalactiae, M. arthritidis, M. bovis, M. cloacale, M. falconis, M. faucium, M. hyosynoviae, M. opalescens, M. primatum, M. pulmonis, M. spermatophilum, M. timone
<9,96 Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: ja

Dieser Kit stellt eine methodische Vereinfachung dar. Die Tubes enthalten bereits Nukleotide, der MasterMix ist fertig und enthält auch schon Ladepuffer. Damit entfallen viele Pipettierschritte. Außerdem ist die Positivkontrolle in eigenen Tubes vorgelegt, sodass seltener Kontaminationen vorkommen. 3 Pipettierschritte insg.
Millepore

rRNA

keine Angabe

GMP: -

Keine Angabe   Milliprobe. Leider ist die Seite wirklich schlecht. Man findet den Test kaum bis gar nicht und wenn doch findet man leider keine Infos. Eurofins scheint diesen Mykoplasmennachweis zu verwenden.
Firma Methode/NWG/GMP Spezies Preis Bemerkungen:keine interne Kontrolle
R&D Systems

Hybridization- ELISA

~15 - 2500 KBE

GMP: -

8 (ja/nein) = 
  • A. laidlawiiM. orale, M. arginini, M. hyorhinis, M. fermentans (EuPharm 5 von 7-9)
  • M. hominis
  • M. pirum
  • M. salivarium
 ~4 Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: nein

In diesem Assay wird rRNA von Mykoplasmen über einen ELISA colorimetrisch nachgewiesen. Der Assay kreuzreagiert mit Lactobacillus und ist damit nicht mykoplasmen-spezifisch.  
MycoProbe®
Agilent

PCR-Gel

n.a.

GMP: -

die meisten (ja/nein) ~9,8 Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: nein

Dieser Kit enthält nur Primer. Polymerase und Reaktionspuffer sind nicht enthalten. Über einen Restriktionsverdau können 5 Spezies identifiziert werden. Es wird nicht angegeben, welche Mykoplasmen genau mit "die meisten" gemeint ist. Die interne Kontrolle ist nur eine DNA und somit eine PCR-Kontrolle.
Mycoplasma Plus Primer set

* Price is price/sample when purchasing a normal size kit including all reagents.

 

Mykoplasmen-Nachweis-Kits - weniger sensitive Methoden

 

Firma Methode/NWG/GMP Spezies Preis Bemerkungen: Pharma-Kits
N.A.

Hoechst oder DAPI Färbung

NWG: 1 bis 100 Mio.

GMP: Inprozesskontrolle

Alle.   Immunfluoreszenz mittels DAPI oder Hoechst-Färbung zeigt Mykoplasmen als Schleier auf der Zelloberfläche. Wenig sensitiv ohne langwierigen Assay. Aber schnell und extrem günstig. Für Forschungslabore die mikroskopieren immer eine gute Zusatztestung!
Lonza

Lumineszenz

NWG: 10.000 bis 1.000.000/mL

GMP: nein

Keine Angabe.   Photometrische Bestimmung von Reaktionsprodukten im Zellkulturmedium nach Zugabe eines Reagenzes mittels ELISA Reader. Schnell.
Invivogen

Isothermale PCR, Testkammern

NWG: mit 100 CFU/mL angegeben

GMP: nein

U.a.: M. orale, M. hyorhinis, M. arginini, M. fermentans, M. hominis, and A. laidlawii.   Testkammern, ähnlich den Corona-Schnelltests mit 1 oder 2 Banden nach Ende der Reaktion, Schnell.
Invivogen

Zell-basierte Absorbanz

NWG: 5*102-5*105 CFU/ml

GMP: nein

Wahrscheinlich mind. M. orale, M. hyorhinis, M. arginini, M. fermentans, M. hominis. Keine genau Angabe   Mit Hilfe einer Detektorzelllinie werden Mykoplasmen im Zellkulturmedium von Testzellen nachgewiesen. Messung über ELISA Reader oder optisch innerhalb einer Platte.

* Price is price/sample when purchasing a normal size kit including all reagents.

 

Anforderungen der EuPharm.:

Folgende Stämme werden für die Validierung eines Mykoplasmen-Nachweises gemäß Pharmacopoiea als Kontrollstämme gefordert. Die Nachweisgrenzen, die man erreichen muss, liegen je nach Test bei 10-100 KBE pro ml. Je nach Produkt wird ein (vorgegebener) Stamm auch als Positivkontrolle mitgetestet:

  • A. laidlawii
  • M. fermentans
  • M. hyorhinis (where cell-culture enrichment is used, a fastidious strain such as ATCC 29052 is included)
  • M. orale
  • M. pneumoniae or M. gallisepticum
  • M. synoviae (where there is use of or exposure to avian material during production)
  • Mycoplasma arginini
  • Spiroplasma citri (where there is use of or exposure to insect or plant material during production)

 

Die wichtigsten Zellkultur-Mykoplasmen sind

  • M. orale
  • M. hyorhinis
  • M. arginini
  • M. fermentans
  • M. salivarium
  • M. hominis

 

 
 

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